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乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒

價(jià)格：在線咨詢

貨號(hào)：

FKU0188

產(chǎn)品規(guī)格：

100T

品牌：

萬物

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產(chǎn)品詳情操作說明注意事項(xiàng)

產(chǎn)品描述

乳酸脫氫酶（LDH）是糖酵解途徑的末端酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中，參與催化丙酮酸和乳酸之間的可逆反應(yīng)。通常LDH在細(xì)胞胞漿內(nèi)含量豐富，正常細(xì)胞由于細(xì)胞膜的屏障保護(hù)作用，胞內(nèi)LDH不能隨意通過細(xì)胞膜。但當(dāng)細(xì)胞受到損傷或者死亡時(shí)，細(xì)胞膜的屏障保護(hù)作用消失，細(xì)胞內(nèi)的LDH被釋放至培養(yǎng)液中。通過檢測細(xì)胞膜破裂釋放到培養(yǎng)液中的LDH含量，即可對細(xì)胞毒性進(jìn)行定量分析。

乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒主要原理是利用LDH將NAD⁺被還原成NADH，進(jìn)一步NADH和INT（四唑鹽）在Diaphorase（硫辛酰胺脫氫酶）催化下，生成NAD⁺和紅色甲臜，甲臜產(chǎn)生的量和LDH的含量成線性正相關(guān)，且能夠在490 nm波長下產(chǎn)生吸收峰，因此可以通過儀器進(jìn)行定量分析。本試劑盒主要用于以LDH釋放為指標(biāo)的細(xì)胞毒性檢測，同時(shí)也可用于以細(xì)胞總LDH為基礎(chǔ)的細(xì)胞增殖和毒性檢測。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

冰袋(wet ice)運(yùn)輸；-20℃保存，INT溶液需避光保存，酶溶液避免反復(fù)凍融；12個(gè)月有效。

操作步驟

1. 樣品前準(zhǔn)備：

1) LDH釋放檢測樣品準(zhǔn)備：

a. 細(xì)胞接種：將細(xì)胞以合適的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置多個(gè)分組，例如：背景空白對照孔（僅含細(xì)胞培養(yǎng)基）、樣品對照孔（未經(jīng)處理的細(xì)胞孔）、樣品最大酶活性對照孔（未處理孔，細(xì)胞裂解后測胞內(nèi)總LDH量）、處理樣品孔（實(shí)驗(yàn)組）等；

b. 細(xì)胞處理：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，除去原有培養(yǎng)基，使用PBS緩沖液洗滌一次，根據(jù)分組換上對應(yīng)的含藥物或者不含藥物的無血清或低血清培養(yǎng)基，并孵育一定時(shí)間；

c. 樣本收集：將細(xì)胞培養(yǎng)板1000 g離心5 min，取80 μL培養(yǎng)上清液，加到新的96孔板中，隨后對樣品進(jìn)行測定（樣品最大酶活性對照孔的樣品準(zhǔn)備工作，請參考細(xì)胞內(nèi)總LDH檢測樣品準(zhǔn)備步驟）。

2) 細(xì)胞內(nèi)總LDH檢測樣品準(zhǔn)備：

a. 細(xì)胞接種：將細(xì)胞以合適的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置多個(gè)分組；

b. 細(xì)胞處理：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用含藥物或者不含藥物的培養(yǎng)基（可含血清）孵育細(xì)胞；

c. 細(xì)胞裂解：達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，去除原培養(yǎng)基，用PBS洗滌一遍，加入120 μL細(xì)胞裂解工作液（10×細(xì)胞裂解液使用PBS稀釋10倍），并于培養(yǎng)箱中孵育30-60 min；

d. 樣本收集：將細(xì)胞培養(yǎng)板1000 g離心5 min，取80 μL裂解上清液加到新的96孔板中，隨后進(jìn)行測定。

3) （選做）LDH標(biāo)準(zhǔn)樣品準(zhǔn)備：

如需對LDH酶活性的進(jìn)行絕對定量，請自行購買和配制不同濃度LDH標(biāo)準(zhǔn)品，濃度可設(shè)置為10 mU/mL、5 mU/mL、2.5 mU/mL、1.25 mU/mL、0.65 mU/mL、0 mU/mL。以每孔80 μL，梯度加至96孔板中。

2. LDH檢測：

1) 根據(jù)待測樣品數(shù)量，參考下表配制適量的LDH檢測工作液（主要對應(yīng)96孔板檢測，其他規(guī)格的孔板，可視情況進(jìn)行調(diào)整）；

	1個(gè)樣品	10個(gè)樣品	20個(gè)樣品	50個(gè)樣品
反應(yīng)底物	20 μL	200 μL	400 μL	1 mL
INT溶液	2 μL	20 μL	40 μL	100 μL
酶溶液	3 μL	30 μL	60 μL	150 μL
反應(yīng)緩沖液	55 μL	550 μL	1.1 mL	2.75 mL
總體積	80 μL	800 μL	1.6 mL	4 mL

2) 將LDH檢測工作液，加入到待檢測樣品孔中，每孔80 μL（樣本與LDH檢測工作液體積比為1:1），輕敲混均；

3) 將其放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，避光孵育30 min，也可用錫箔紙包裹，室溫于水平搖床上孵育30 min；

4) 使用酶標(biāo)儀，在490 nm處測定吸光度?？墒褂?00 nm或大于600 nm的任一波長作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。

3. LDH結(jié)果計(jì)算：

1) 常規(guī)LDH（釋放）細(xì)胞毒性檢測：

a. 將樣品對照孔、樣品最大酶活性對照孔、處理樣品孔等OD490減去背景空白對照孔OD490，并用于后續(xù)的計(jì)算；

b. 細(xì)胞毒性或死亡率計(jì)算（%）=（處理樣品孔OD490－樣品對照孔OD490）/（樣品最大酶活性對照孔OD490－樣品對照孔OD490）×100%

2) LDH酶活性的相對定量（根據(jù)計(jì)算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異等）：

a. 測定一個(gè)已知濃度的LDH標(biāo)準(zhǔn)品OD490；

b. 待測樣品LDH活性（mU/mL）=（樣品孔OD490－背景空白對照孔OD490）/（標(biāo)準(zhǔn)品OD490－背景空白對照孔OD490）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mU/mL）

3) LDH酶活性的絕對定量:

a. 測定一系列LDH梯度標(biāo)準(zhǔn)品OD490，根據(jù)所得的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出趨勢公式：Y（OD490）=A×LDH活力單位（mU）+B，可通過Excel等軟件計(jì)算出趨勢線的斜率和截距；

b. 檢測體系中LDH活性（mU）=（樣品孔OD490－背景空白對照孔OD490－B）/A

樣品LDH活性（mU/mL）=檢測體系中LDH活性（mU）/檢測體積（mL）

注意事項(xiàng)

1. 細(xì)胞檢測時(shí)，密度不要超過85%，細(xì)胞的狀態(tài)和密度等因素都會(huì)對細(xì)胞LDH釋放造成一定的影響，且樣品準(zhǔn)備好后，盡量當(dāng)天完成檢測，不要冷凍；

2. 血清中含有乳酸脫氫酶，建議使用無血清或者低血清培養(yǎng)基；如必須使用10%血清，需設(shè)置無細(xì)胞對照組，以消除背景干擾；

3. 操作時(shí)盡量溫和，避免產(chǎn)生氣泡，以免對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響；

4. 為了您的健康和安全，操作時(shí)請穿好實(shí)驗(yàn)服、戴好手套。

本產(chǎn)品僅供科研用途，不用于臨床診斷！

凡合肥萬物生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品均有嚴(yán)格的質(zhì)量保證。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在包裝規(guī)格疑問，請于收貨之日起七日內(nèi)向我公司總部或當(dāng)?shù)剞k事處提出，并請保證該產(chǎn)品，以備本公司進(jìn)行核對檢驗(yàn)。如果發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問題，請于收貨后一月內(nèi)保留產(chǎn)品50%以上的量，以便本公司回收產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)檢，確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量。如逾期，則視為已經(jīng)對本公司產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)收。聲明：如發(fā)生產(chǎn)品索賠事宜，本公司僅在產(chǎn)品價(jià)格范圍內(nèi)酌情賠償，恕不接受超出產(chǎn)品價(jià)格范圍之賠償?？蛻粼谑褂眠^程中有任何技術(shù)問題可以撥打技術(shù)售后服務(wù)電話我們隨時(shí)給予解答。

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